Experimental study on solidification of silt through urease-producing strains induced by ultraviolet mutagenesis
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摘要: 为提高微生物诱导碳酸钙沉淀(MICP)技术的固化效果,采用紫外诱变技术对产脲酶菌株进行改良,筛选出优良菌株。随后结合先拌和菌液后滴注胶结液(尿素和氯化钙)的方式,运用改良后菌株来固化粉土。通过无侧限抗压强度试验、碳酸钙含量测定和微观试验分析,来对比诱变前后菌株固化粉土的效果。结果表明:紫外诱变技术可以有效改良产脲酶菌株的性能,使菌株的脲酶活性、矿化生成的碳酸钙含量得到提高;使用紫外诱变后菌株来固化粉土,可显著提高土体的无侧限抗压强度。该研究从源头来选育优良菌株,有效提高了MICP技术的固化效果。Abstract: To improve the solidification effects of the microbially induced calcium carbonate precipitation (MICP) technology, the urease-producing strains are optimized by the ultraviolet (UV) mutagenesis. Subsequently, the modified bacterial strains are used to solidify silt by premixing bacterial with soil first and then injecting cementation solution (urea and calcium chloride) into soil. The unconfined compressive strength tests, calcium carbonate content determination and microscopic test analysis are conducted to comparatively study the curing effects of the strains before and after the UV mutagenesis. The results show that the UV mutagenesis technology can effectively improve the performance of the urease-producing bacterial strains, and increase the urease activity and the content of calcium carbonate produced by mineralization. The use of UV-induced bacterial strains to solidify silt can significantly improve the unconfined compressive strength of the soil. This study selects the excellent bacterial strains from the source and effectively improves the curing effects of the MICP technology.
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0. 引言
微生物诱导碳酸钙沉淀技术(microbially induced carbonate precipitation,MICP)是岩土工程领域的一个研究热点,发展至今吸引了许多学者的关注。微生物岩土技术主要是指利用自然界广泛存在的微生物,通过其自身的代谢功能与环境中其他物质发生一系列生物化学反应,吸收、转化、清除或降解环境中的某些物质,通过生物过程诱导形成碳酸盐、硫酸盐等矿物沉淀,从而改善土体的物理力学及工程性质,达到环境净化、土壤修复、地基处理等目的[1],具有绿色环保的优点[2-3]。
随着研究的不断深入,人们越来越关注MICP技术的矿化效率和固化效果,为此通过各种方式来优化这项技术[4-6]。黄涛等[7]以活性氧化镁和微生物共同作用固化的黄土试样为研究对象,发现反应生成的水合碳酸镁具有膨胀性和胶结性,能够填充土颗粒之间的缝隙,促使土颗粒胶结在一起,提高加固效果。马国梁等[8]提出一种基于微粒固载成核的微生物固化技术(MICPMPIN),来改善MICP固化粗砂的力学特性,结果表明新型MICPMPIN固化粗砂的强度高于传统MICP固化粗砂的强度。郑俊杰等[9]运用纤维加筋的方法来改善微生物固化砂土的强度和韧性。现今从菌种的选择到培养基的改良,从加固方法的改进到纤维材料的添加[10-13],研究者们运用各种方法来提高MICP技术的矿化效率,但大部分都是对反应过程或技术方法来进行改良,从源头上对菌株本身的改良还较少[14-15]。
巴氏芽孢杆菌是MICP技术经常使用的菌株,此类菌株在一定条件下能够产生抗逆性内生孢子,在自然条件下突变概率较低,突变幅度较小。现今单纯依赖自然突变来选育菌株已不能满足生产和研究需要。此外,诱变育种技术在中国已十分成熟,已普遍使用在生物、农业、医学等方面。其中紫外诱变育种更是具有不涉及诸多安全问题、操作便捷、变异频率高和突变幅度大等诸多优点[16-17]。
基于以上研究现状,本文采用紫外诱变育种技术对巴氏芽孢杆菌进行改良,通过测量诱变前后菌株电导率、碳酸钙含量、OD600值,采用T检验的手段筛选出改良效果显著的菌株。随后参考赵志峰等[18]固化粉土的手段,采用先拌和菌液后滴注胶结液并两头滴注的方式,用诱变后的菌株来加固黄泛区粉土。利用无侧限抗压强度试验与微观结构分析,来探讨改良菌株固化粉土的力学效果和微观特性。
1. 紫外诱变脲酶菌株试验
1.1 试验材料
试验用菌采用的是巴氏芽孢八叠球菌(Spor- osarcina pasteurii,菌种库编号ATCC11859),培养基使用LB培养基,配置为1 L去离子水中加入10 g蛋白胨、5 g酵母浸粉、10 g氯化钠,搅拌均匀后加入2 mol/L NaOH溶液,调节pH值为8。胶结液由氯化钙与尿素组成,按1︰1进行混合,浓度为1 mol/L。辐射源为SH-2简易型中波紫外线光疗仪,辐射强度为15 mW/cm2,辐照面积为11 cm×2 cm,固定高度为距菌液垂直高度10 cm处。PBS缓冲液、摇菌管、培养皿等均进行高压高温灭菌(121℃,25 min)。
1.2 试验方法
(1)菌液制备与保存
按以上配方配置1 L培养液,用耐高温无菌封口膜封紧,进行灭菌。冷却后在无菌操作台内进行分装,4℃冷藏备用。随后对购买的巴氏芽孢八叠球菌冻干粉进行多次活化(4次),使活性得到有效恢复。之后取适量甘油加入50%去离子水,灭菌25 min冷却至室温备用。最后,吸取700 μL菌液、300 μL甘油(50%甘油)至1.5 mL离心管内,于-80℃进行长期保存;吸取2 mL菌液接种至200 mL培养液内(按1%接种),在恒温振荡培养箱(30℃,170 r/min)培养30 h后4℃冷藏保存。
(2)紫外诱变试验方法
a)原菌制备
在无菌操作台内,将培养好的菌液混合均匀,吸取5 mL菌液至12 mL摇菌管内(2管,备用),以此菌种作为诱变试验原菌。
b)紫外诱变前准备
将原菌移取至离心管内,每管吸取1 mL菌液,随后以4000 r/min的转速离心4 min。离心结束后吸去上清液,加入1 mL PBS缓冲液,洗涤1次。随后吸取80 μL混合液移至摇菌管,加入PBS缓冲液按10倍梯度稀释至10-2备用[19-20]。
c)紫外诱变试验
每管分别吸取2 mL菌液移至Φ35 mm培养皿内,在无菌环境中保存备用。固定紫外灯位置,提前预热20 min。随后在无菌操作台内打开培养皿,逐个照射至设计时长(照射时长设为0,15,20,25,30,35 min,分别记为N-0,M-15,M-20,M-25,M-30,M-35)。之后将紫外照射后的培养皿在无菌操作台内严格遮光存放12 h,避免光复活对诱变的影响[21]。
d)平板涂布
诱变结束后,在无菌操作台内将菌液浓度用LB培养液稀释10倍,即每皿吸取20 μL菌液至离心管,再加入180 μL LB培养液。混合均匀后,每离心管内吸取30 μL,平板涂布至尿素琼脂基础(Φ60 mm),倒扣、遮光、30℃恒温培养12 h。紫外诱变产脲酶菌株试验流程见图 1。
(3)紫外诱变后菌株初筛
将紫外诱变后的尿素琼脂平板与照射0 min的尿素琼脂平板(对照组)进行对比,通过统计菌落数量,挑选出致死率在80%~90%的尿素琼脂平板[22]。然后选取平板内颜色深红、生长面积相比其他菌株较大的菌株,单株接种到5 mL培养液内,每个平板内筛选出3株菌株,在恒温振荡培养箱内30℃,170 r/min培养5代,以确保菌株遗传物质稳定,不发生逆转突变[23]。
(4)改良菌株筛选
对培养5代的菌株进行研究,按1︰100体积比将菌株接种到pH值为8的LB培养液内,恒温振荡培养24 h,经可见分光光度计测量每管菌株OD600值保持在1.35±0.01内。随后对各管菌株的脲酶活性进行测量。具体操作:30℃恒温下吸取1 mL菌液与9 mL 1.1 mol/L尿素溶液混合,运用电导率仪监测并记录菌株5min内电导率变化量,计算出平均每分钟菌株的电导率变化值,依据Whiffin提出的计算方法[24],即可得到每分钟内尿素的水解量,即脲酶活性。随后取20 mL菌液与20 mL胶结液混合,室温下放置3 d,采用EDTA滴定法来测定每管菌株矿化生成的碳酸钙含量。最后,采用GraphPad Prism软件对诱变前后菌株脲酶活性、碳酸钙含量进行T检验分析(T检验是一种适合小样本数据的(一般定义样本数 < 30)统计分析方法,即通过比较不同数据的均值,研究两组数据之间是否存在差异,主要是用来检测数据的显著性),筛选出改良效果极显著的菌株。
(5)改良后菌株生长特性研究
将筛选后的菌株、诱变前菌株N-0分别接种至pH为8的培养液内,30℃,170 r/min条件下恒温振荡培养,每隔12 h测一次脲酶活性与OD600值,共培养72 h,观测随着时间增长诱变前后菌株生长情况。
为了研究紫外诱变后菌株脲酶活性的稳定性,对筛选出的改良菌株与未改良菌株N-0进行对比。按1︰100体积比分别接种至pH值为8的LB培养液内,30℃,170 r/min恒温振荡培养。共接种10次,每次接种分别测量二者的脲酶活性与OD600值,分析改良菌株在接种10次中的遗传稳定性。
2. 紫外诱变前后菌株固化粉土试验
试验所用土样为取自河南省开封市,粒径分布如表 1所示。采用标准击实试验测出土体最优含水率为15.11%,最大干密度为1.69 g/cm3,液、塑限分别为26.5%,16.7%,根据《建筑地基基础设计规范》[25],试验所用土体为粉土。试验前将土体烘干过2 mm筛备用,按照最优含水率制备试样。先称量2000 g干土,加入302 mL菌液(菌液M-25与菌液N-0脲酶活性分别为15.3,12.8 mmol/(L·min),OD600值均为1.5±0.1),拌和均匀用保鲜膜密封,闷料12 h。随后称取176 g土体分3次装入PVC管模具内(内径39.1 mm,高80 mm),采用分层击实法制样。
表 1 粉土的粒径分布Table 1. Grain-size distribution of silt粒径/mm < 2 < 1 < 0.5 < 0.25 < 0.1 < 0.074 颗粒质量百分数/% 100 99.8 98.6 97 81 60.4 采用滴注的方式来加固粉土[26],胶结液浓度为1 mol/L,使用蠕动泵进行滴注,滴注速度为1 mL/min。试样采用两头滴注,每天滴注一轮,每轮滴注胶结液20 mL。滴注方案如表 2所示,粉土固化试验如图 2所示。每轮滴注完成后将试样放入35℃恒温箱内,在此温度下可以有效保持菌株活性,使矿化反应可以持续进行[24]。滴注到设计滴注轮数后,在相同滴注速度下向试样内滴注一轮同体积的去离子水,用来冲洗试样内未反应的化学物质。随后将试样在恒温50℃烘箱内放置7 d,对试样进行烘干处理[27]。其中,M-25与N-0组试样除胶结液滴注轮数不同外,其余均是在相同环境下进行制作,尽量避免试验误差带来的影响。最后在试样烘干后,对其进行无侧限抗压强度试验。
表 2 紫外诱变脲酶菌株加固粉土试验方案Table 2. Test schemes for reinforcement of silt by UV mutagenic urease strains试验序号 试验方案 胶结液滴注
轮数试验编号 1 未诱变菌株N-0 1 N-0-1 3 N-0-3 5 N-0-5 7 N-0-7 2 诱变后菌株M-25 1 M-25-1 3 M-25-3 5 M-25-5 7 M-25-7 注:滴注8轮时试样滴注处开始堵塞,胶结液已无法滴注。 在无侧限抗压强度试验结束以后,取无侧限抗压强度试验破坏后的试样进行碳酸钙含量测定与SEM(扫描电镜)试验,从微观角度来分析改良菌株对粉土的固化效果。同时运用光学显微镜对加固粉土所用的菌株进行观察,对改良前后菌株的形态进行分析。
3. 试验结果及分析
3.1 菌株筛选
诱变后菌株在尿素琼脂平板内进行初步筛选,由于脲酶水解尿素会产生大量氨,使培养基pH值趋于碱性,促使尿素琼脂平板变红,故以此来筛选产脲酶菌株。图 3为诱变前后菌株在尿素琼脂平板内的生长情况,菌落数量统计结果如表 3所示,与对照组照射0 min相比,仅有紫外照射25,30,35 min平板内菌株致死率在80%以上,满足诱变试验要求[17],因此从照射25,30,35 min尿素琼脂平板内筛选产脲酶菌株。筛选出颜色较深、生长圈较大的菌株,每平板内筛选出3株随后进行单株培养。
表 3 诱变致死率Table 3. Mortality rates of mutation编号 菌落数量/个 致死率/% N-0 620 0 M-15 271 56 M-20 166 73 M-25 93 85 M-30 64 90 M-35 50 92 紫外诱变之后产脲酶菌株的脲酶活性变化情况如图 4所示。与对照组N-0相比,紫外照射试验组M-25,M-30,M-35组脲酶活性均有提高。其中M-25组提高最大,且M-25-1,M-25-2,M-25-3脲酶活性均高于对照组N-0-1,N-0-2,N-0-3,提高了30%~45%,表明利用紫外照射的方式可以有效提高产脲酶菌株的脲酶活性。结合T检验分析来看,紫外照射30,35 min菌株的脲酶活性与照射0 min菌株相比其P值(P值即一组数据的均值在另一组数据的均值所代表的总体内出现的概率,P > 0.05表示差异性不显著;0.01 < P < 0.05表示差异性显著;0.01 < P < 0.05表示差异性极显著),菌株改良效果不显著。紫外照射25 min时其P < 0.01,菌株改良效果极显著。
结合诱变菌株脲酶活性情况,对改良菌株M-25、M-30、M-35进行EDTA滴定,测定每管菌株矿化产生的碳酸钙含量,结果如图 5所示。M-25菌株与N-0菌株相比碳酸钙含量提高了20%~40%,与脲酶活性提高情况相似。经T检验分析可知与对照组N-0相比仅有菌株M-25组的碳酸钙含量P < 0.01,因此菌株M-25组碳酸钙含量提升效果极显著。综合来看,仅有菌株M-25的脲酶活性、碳酸钙含量提高最大,改良效果极显著。这大致是由于紫外线的照射使菌株M-25的DNA发生改变,进而造成菌株M-25酶的改变,激活了其相关酶的合成与表达[28-29]。因此选取菌株M-25作为改良菌株。
3.2 诱变前后菌株生长特性
图 6为诱变前后产脲酶菌株微生物生长数量、脲酶活性随时间变化情况。由左图可以看出在相同条件下,随着培养时间增加改良菌株M-25与未改良菌株N-0其OD600值均有提高。从总体来看在0~36 h内菌株生长速率最快,超过36 h后生长速率逐渐减弱,主要是由于菌株培养液内大部分营养物质随着菌株生长逐渐消耗,在36 h内大部分营养物质被消耗殆尽,仅剩的营养物质已满足不了大部分菌株的生长需求,菌株生长速率受到抑制,因此36 h后菌株OD600值增长速率降低。同时可以明显看出,改良菌株M-25的OD600值随时间变化曲线与未改良菌株N-0变化曲线形态类似,且M-25 OD600值大于N-0的值,说明在相同培养条件下改良菌株M-25的生长数量远大于未改良菌株N-0,此现象对提高反应过程内菌株的脲酶活性具有一定影响。
图 6右图为诱变前后菌株脲酶活性随时间变化情况,可知菌株脲酶活性随时间增长呈先增大后减小的趋势。在培养36 h时脲酶活性达到最大值,超过36 h后脲酶活性大幅减小,且改良菌株的脲酶活性始终高于未改良菌株20%左右。结合图 6由此可以得知改良菌株与未改良菌株最优培养时间为36 h。
随后对改良菌株遗传稳定性进行分析,图 7为诱变前后产脲酶菌株脲酶活性与OD600值随接种代数的变化情况。结合两图可以看出,改良菌株M-25在1代~4代内遗传物质总体保持稳定状态,其电导率稳定在15.3 mmol/(L·min)左右,而未改良菌株N-0稳定在12.8 mmol/(L·min)左右,二者脲酶活性始终相差20%以上;在5代后改良菌株与未改良菌株脲酶活性均逐渐降低,但改良菌株脲酶活性始终高于未改良菌株15%~26%。同时,相同培养条件下改良菌株OD600值的变化趋势与未诱变菌株基本相似,总体来看改良菌株OD600值始终大于未改良菌株。因此,改良菌株在10代内遗传物质稳定,产脲酶能力始终大于未改良菌株,且在4代内脲酶活性基本保持一致。
3.3 改良菌株对固化粉土力学性能的影响
(1)改良前、后菌株不同方案下土柱无侧限抗压强度(UCS值)
图 8为不同方案下加固土柱的破坏模式,可以看出加载后试样破坏形态基本相似,改良前后菌株固化的粉土试样基本都为劈裂破坏。大部分土柱在破坏时都是主裂缝从顶部开始向底部扩展,然后在主裂缝周围分布着若干小裂缝。从这种现象可以看出试样在滴注时,胶结液进入较均匀,矿化时生成的CaCO3分布较均匀。
运用改良前与改良后的菌株来加固粉土,通过无侧限抗压强度试验,得到不同处理方案下土柱典型的应力-应变曲线如图 9所示。可以看出随着滴注轮数的增加所有试样的峰值应力均逐渐增大,且改良菌株M-25加固的试样峰值强度均大于未改良菌株N-0加固的试样。同时在滴注7轮时,峰值应力提升尤为突出。以改良菌株M-25加固的试样为例,与滴注5轮时相比提高了1.29 MPa,是素土峰值应力的6.5倍。此外,在滴注7轮时,试样的应力应变曲线在达到峰值强度前呈直线上升,在达到峰值强度后急剧下降,表现出明显的脆性破坏。
(2)不同试验组UCS值和碳酸钙含量的关系曲线
采用酸洗的方法对土柱内生成的碳酸钙含量进行测量[27]。先对无侧限抗压强度试验后的试样进行选取,并用去离子水对试样进行冲洗,使土样中的可溶盐充分溶解,去除盐分烘干称重。随后用浓度为1 mol/L的稀盐酸对试样进行浸泡,等完全反应后抽去上清液,用去离子水对样品进行多次清洗,最后烘干称重。土柱清洗前后质量变化即为土柱内碳酸钙含量。滴注轮数与UCS值和碳酸钙含量的关系如图 10中所示。可以看出随着滴注轮数的增加,试验组N-0与M-25 UCS值均随碳酸钙含量的升高而增加,在滴注7轮时达到最大。满足刘汉龙等[1]、何稼等[10]提出的碳酸钙含量与UCS值的关系变化情况。其中,M-25组碳酸钙含量始终高于N-0组,在滴注7轮时达到7.8%,UCS值也始终大于N-0组,在滴注7轮时达到2.21 MPa,相比N-0组提高了25%。
此外,结合图 10(a),(b)可看出在滴注8轮时,试样UCS值相比滴注7轮时相差不大,诱导生成的碳酸钙含量也大致相同。此现象主要是由于在滴注7轮时,土体内部碳酸钙生成量达到最大。在滴注8轮时由于土体内碳酸钙的堵塞,胶结液已无法滴入,溶液残存在试样上部,已不能生成胶结物质,因此强度提高不大。故从资源节约方面可以判定滴注7轮为最佳滴注轮数。
图 11为不同碳酸钙含量对应的UCS值,由图 11可以看出碳酸钙含量与UCS值具有明显相关性,随着碳酸钙含量增加UCS值呈递增趋势[10]。结合图 10,11可知,改良菌株M-25加固粉土效果优于未改良菌株N-0。主要是由于相同环境下,改良菌株M-25的脲酶活性更高,在单位时间内可以水解更多尿素,促进土体内碳酸钙的生成。这些生成的碳酸钙能有效填充土颗粒间的孔隙,使土颗粒更好的胶结在一起,有效提高了土体的固化效果。
3.4 微观分析
图 12为不同试验组扫描电镜图,可以看出与素土相比试验组M-25与N-0的土体内均有碳酸钙生成,有效填充了土颗粒之间的孔隙。在滴注1轮时,生成的碳酸钙较少,不足以填充土颗粒间的孔隙,如N-0-1与M-25-1所示。随着滴注轮数的增加,矿化生成的碳酸钙含量逐渐增大。在滴注7轮时能明显看到大量碳酸钙生长在土颗粒孔隙内,将土颗粒胶结在一起。结合N-0-7与M-25-7进行分析,可以看出改良菌株组矿化生成的碳酸钙大小相对均匀,紧密堆积在土颗粒周围,大大提高了土体的结构整体性。
图 13为脲酶菌株紫外诱变前后菌体放大250倍形态与滴注7轮时试样扫描电镜图。由图 13(a)可以明显看出,诱变前后菌株形态发生改变,诱变前菌株N-0为细长柱状,诱变后菌株M-25为短小椭圆柱状,体积减小。结合图 13(b)可知,在相同放大倍数下菌株M-25矿化生成的碳酸钙相比N-0来说,个体体积较小且相对均匀,紧密聚集堆积在土颗粒表面。因此,菌株体积减小也是造成生成的碳酸钙晶体小而致密的原因,与肖瑶等[30]研究类似。
4. 结论
(1)对产脲酶菌株进行紫外诱变,发现在相同环境下改良菌株M-25,其脲酶活性与矿化生成的碳酸钙含量相比未诱变菌株N-0分别提高了30%~45%与20%~40%,经T检验分析改良效果极显著。
(2)对诱变前后菌株OD600值与脲酶活性随时间变化情况进行研究,发现菌株最优培养时间为36 h,此时脲酶活性较好,OD600值增长速率较快。改良菌株在10代内遗传物质稳定,产脲酶能力始终大于未改良菌株,在4代内脲酶活性不变。
(3)采用先拌和菌液后滴注胶结液且两头滴注的方式加固粉土,发现改良菌株M-25在滴注7轮时对粉土的固化效果较好,UCS值可达到2.21 MPa,相比N-0组试样强度提高了25%,是素土强度的6.5倍。
(4)紫外诱变后巴氏芽孢杆菌菌体形态发生变化,在固化土体时生成体积较小且致密分布的碳酸钙晶体,提高了土体强度。
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表 1 粉土的粒径分布
Table 1 Grain-size distribution of silt
粒径/mm < 2 < 1 < 0.5 < 0.25 < 0.1 < 0.074 颗粒质量百分数/% 100 99.8 98.6 97 81 60.4 表 2 紫外诱变脲酶菌株加固粉土试验方案
Table 2 Test schemes for reinforcement of silt by UV mutagenic urease strains
试验序号 试验方案 胶结液滴注
轮数试验编号 1 未诱变菌株N-0 1 N-0-1 3 N-0-3 5 N-0-5 7 N-0-7 2 诱变后菌株M-25 1 M-25-1 3 M-25-3 5 M-25-5 7 M-25-7 注:滴注8轮时试样滴注处开始堵塞,胶结液已无法滴注。 表 3 诱变致死率
Table 3 Mortality rates of mutation
编号 菌落数量/个 致死率/% N-0 620 0 M-15 271 56 M-20 166 73 M-25 93 85 M-30 64 90 M-35 50 92 -
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